如何預(yù)防ELISA實(shí)驗(yàn)樣本處理錯誤?

　　一、樣本采集與保存規(guī)范

　　抗凝劑選擇與處理?

　　使用EDTA抗凝血漿時需立即顛倒混勻5-8次，避免局部凝血?。

　　避免使用肝素鈉(可能干擾抗原-抗體結(jié)合)或含疊氮鈉的保存液(抑制HRP酶活性)?。

　　保存條件優(yōu)化?

　　短期檢測(≤7天)樣本可4℃保存，長期需分裝后-80℃凍存，避免反復(fù)凍融(>3次)導(dǎo)致蛋白降解?。

　　組織樣本需加入蛋白酶抑制劑(如PMSF)后勻漿，分裝保存?。

　　二、樣本預(yù)處理關(guān)鍵步驟

　　離心參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化?

　　血清/血漿需3000×g離心20分鐘，4℃操作，確保去除細(xì)胞碎片?。

　　尿液/腦脊液需高速離心(10000×g)或0.22 μm濾膜過濾去除顆粒物?。

　　稀釋與干擾控制?

　　高濃度樣本需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定稀釋倍數(shù)(如1:5至1:20)，避免“鉤狀效應(yīng)”?。

　　溶血樣本需超濾處理或稀釋，避免血紅蛋白干擾顯色?。

　　三、操作流程防錯措施

　　加樣與污染預(yù)防?

　　使用帶濾芯槍頭，每孔更換吸頭，避免交叉污染?。

　　冷藏樣本需室溫平衡30分鐘后再加樣，確保反應(yīng)均一性?。

　　洗滌與封閉規(guī)范?

　　洗滌液需注滿孔內(nèi)(避免殘留)，重復(fù)5-6次，每次靜置30秒?。

　　封閉液推薦5% BSA或脫脂牛奶，孵育≥30分鐘以減少非特異性結(jié)合?。

　　四、質(zhì)控與驗(yàn)證

　　對照設(shè)置?

　　每批次實(shí)驗(yàn)需包含空白孔、陰性對照(健康樣本)及陽性對照(標(biāo)準(zhǔn)品)?。

　　回收率試驗(yàn)：向樣本中添加已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品，驗(yàn)證檢測效率?。

　　儀器校準(zhǔn)?

　　定期校準(zhǔn)移液器(如5-10 μL小體積加樣)和酶標(biāo)儀波長(如TMB底物450nm)?。

　　五、常見問題快速排查

　　顯色淡/靈敏度低?：檢查抗體效價、樣本是否反復(fù)凍融或酶標(biāo)物失活?。

　　高背景信號?：確認(rèn)封閉充分、底物避光保存且孵育時間≤15分鐘?。

　　注：以上僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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